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QIAGEN REPLI-g單細胞基因組分析試劑的相關(guān)原理

更新時間:2021-12-06

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QIAGEN REPLI-g單細胞基因組分析試劑的相關(guān)原理

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放大原理

REPLI-g Single Cell Kit 使用等溫基因組擴增,稱為多重置換擴增 (MDA),它涉及隨機六聚體與變性 DNA 的結(jié)合,然后在恒溫下使用優(yōu)化形式的 Phi 29 聚合酶進行鏈置換合成,具有異常強的鏈置換特性。額外的引發(fā)事件發(fā)生在作為模板的每條被取代的鏈上,從而能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴增 DNA(見圖“ 多位移放大(MDA)技術(shù)")。Phi 29 聚合酶是一種噬菌體衍生酶,是一種具有 3'→5' 引物核酸外切酶活性(校對活性)的DNA 聚合酶,其保真度比Taq DNA 聚合酶高 1000 倍。在*、優(yōu)化的 REPLI-g 單細胞緩沖液系統(tǒng)的支持下,Phi 29 聚合酶可輕松解析二級結(jié)構(gòu),如發(fā)夾環(huán),從而防止聚合酶在擴增過程中滑動、停止和解離。這使得生成高達 100 kb 的 DNA 片段而沒有序列偏差。

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細胞裂解和 DNA 堿變性

基因組 DNA 在用于酶促擴增程序之前必須變性,這通常使用苛刻的方法來完成,例如在高溫下孵育(熱孵育)或增加 pH 值(化學(xué)堿性孵育)。REPLI-g Single Cell Kit 使用溫和的堿性孵育,允許細胞裂解和 gDNA 的均勻 DNA 變性,DNA 片段化或無堿基位點的產(chǎn)生非常低。這導(dǎo)致擴增的 DNA 具有非常高的完整性,并使擴增片段的長度,從而使基因組位點和序列均勻呈現(xiàn)。

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有效消除可檢測的 DNA 污染

所有 REPLI-g Single Cell Kit 組件都經(jīng)過*的受控凈化程序,以確保消除所有 REPLI-g 可擴增的 DNA 污染。緩沖液和試劑通過創(chuàng)新和標準化的程序暴露在紫外線輻射下,以確保不存在任何可檢測的殘留污染 DNA(見圖“ 創(chuàng)新的去污程序")。紫外線處理后,試劑盒經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制,以確保功能齊全。